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    miRNA定量檢測解讀

  3. 發布日期:2014-10-14      瀏覽次數:2140
    •    miRNA定量檢測就是在PCR擴增過程中,通過熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系,所以成為定量的依據。由于miRNA定量檢測的眾多優點,現在已經是生命科學領域的一項重要技術,并成為基因表達差異和文章發表*的部分。miRNA定量檢測輸出的數據不同于常規PCR電泳檢測,很多沒有做過miRNA定量檢測的研究者常常感到高深莫測,不知從何入手;甚至一些做過一些實驗的研究者也會對數據處理分析感到迷惑。很多時候,盡管知曉qPCR的原理和基本操作,仍然浪費時間和精力,而得不到好的結果或對大量的數據不知所措。
        上海基屹生物科技有限公司的miRNA定量檢測技術服務,根據實驗目的,設計實驗方案(相對定量或定量;SYBR Green I或Taqman探針方法),用*按照符合標準(MIQE)的miRNA定量檢測試劑完成實驗,提供符合文章發表的客觀事實實驗報告和原始數據。
        miRNA定量檢測是 19~28 nt 的調控RNA分子,主要包括微 RNA(micro RNA,miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA,siRNA)兩類,其中的miRNAs成為繼 siRNAs之后新的研究熱點之一,名列2002年和2003年美國《科學》雜志評出的年度科學成就。
        miRNA定量檢測中的miRNA是長片段RNA序列的一部分,同siRNAs一樣是比較短小的單鏈小分子RNA,一般來源于染色體的非編碼區域,由大約70 nt大小的可形成發夾結構的前體加工而來,miRNA定量檢測通過與其目標mRNA分子的3 端非編碼區域(3-untranslated region,3 UTR)互補導致該mRNA分子的翻譯受到抑制。
        要了解miRNA在基因調控中扮演的角色,很關鍵的一個方法就是迅速、準確地定量檢測miRNA基因的表達。因此,miRNA定量檢測表達水平的檢測也成為了科學家們研究的熱點。但是由于小分子RNA是一類很小的分子,部分小分子RNA表達水平可能很低,因而需要極為靈敏而定量的分析工具。miRNA定量檢測常用的檢測方法有:
        1.  Northern blotting
        2.  核糖核酸酶保護分析以及基于此方法的液相雜交。
        3.  RT-PCR也被用來miRNA定量檢測前體的表達水平, 其他基于PCR技術檢測miRNA的方法有引物延伸法,就是在引物的5 末端加一個特異標記,可以定量測定低豐度的RNA含量;原位雜交技術(CISH,FISH)可以方便的檢測miRNA的時空表達的差異。
        4.  芯片(microarrays)技術[46,47]是一種較快的研究miRNA表達的方法。
        miRNA定量檢測方法克服了由于miRNA分子太短(~22 nt)帶來的定量zui大難題而引入靶向特異性的反轉錄引物,該RT引物可以與成熟miRNA結合,形成反轉錄引物/成熟miRNA復合物,并在miRNA的5’末端延伸。這樣就得到一個較長的反轉錄擴增因子,為進一步做實時定量PCR提供了符合要求的摸板。
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