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    RNA抽提

    簡要描述:RNA可分為信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取實質(zhì)就是將細胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì),Z終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程。 由于RNA樣品易受環(huán)境因素特別是RNA酶的影響而降解,提取高質(zhì)量的RNA樣品在生命科研中具有相當?shù)奶魬?zhàn)性。RNA提取對樣品的新鮮性要求非常高,獲取樣品后立即提取RNA,若無條件立即實驗,應(yīng)于-80℃或液氮中。

    • 產(chǎn)品型號:
    • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
    • 更新時間:2024-05-13
    • 訪  問  量:3817
     RNA抽提操作步驟:
      1. 勻漿處理:
      a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
      b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
      c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
      2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物*分離。
      3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質(zhì),脂肪,多糖或胞外物質(zhì)(肌肉,植物結(jié)節(jié)部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
      5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
      6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
      7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
      8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
      9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。
      10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

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